نگهداري و استفاده از سويه‌هاي باکتريايي

براي نگهداري سويه‌هاي باکتريايي مي‌توان از  روشهاي طولاني مدت و کوتاه مدت استفاده نمود.

نگهداري طولاني مدت

نگهداري طولاني‌مدت باکتريها اين امکان را مي‌دهد که کليه سويه‌هاي ميکروبي اعم از هوازي (بارشد سريع ويا سخت رشد) ونيز بيهوازي ، ماهها و حتي سالها به صورت زنده نگهداري شوند. بهترين روشهاي نگهداري طولاني مدت شامل ليوفيليزاسيون (Freeze drying) و نگهداري در دماي 70- درجه سانتي‌گراد يا پايين تر ( در ديپ فريز يا در نيتروژن مايع ) مي‌باشد.

1-  نگهداري در ديپ فريز ( 50- تا 70- درجه سانتي‌گراد يا پايينتر) ويا نيتروژن مايع :

باکتري مورد نظر را روي محيط مغذي مانند پليت TSA ( Trypticase Soy Agar )   حاوي 5% خون گوسفند و در مورد ميکروارگانيسمهاي سخت رشد روي محيط آگار شکلاته کشت دهيد. پليتها را به مدت 24-18 ساعت در دماي 2±35 درجه سانتي‌گراد و در صورت نياز تحت شرايط CO₂ براي هر باکتري انکوبه نمائيد.

بعد از انکوباسيون، خالص بودن و مورفولوژي کلني‌ها را بررسي نموده و در صورت نياز، تستهاي بيوشيميايي آنرا انجام دهيد. سپس از باکتري رشد يافته ، سوسپانسيون غليظي در 100-50 ميلي‌ليتر از يک محيط محافظت‌کننده از سرما (Cryoprotective ) تهيه نمائيد. اين محيط براي جلوگيري از تخريب سلولهاي باکتري در شرايط انجماد مورد استفاده قرار مي‌گيرد. محيط محافظت‌کننده از سرما مي‌تواند Skim milk ، خون گوسفند يا خرگوش دفيبرينه استريل يا Tryptic Soy Broth (TSB)  حاوي گليسرول با غلظت نهايي 15-10% باشد.

سپس از سوسپانسيون باکتريايي فوق به مقدارmL 1- 5/0 در ويالهاي شيشه‌اي يا پلاستيکي کوچک استريل توزيع کنيد . تعداد ويال ذخيره خود را براي مصرف يکسال آماده نمائيد.

ويالهاي حاوي سويه‌ها را مي‌توان در برودت  50- تا 70- درجه سانتي‌گراد به مدت يکسال نگهداري نمود. در صورت عدم دسترسي به فريزر 70- درجه مي توان سويه‌هاي با رشد سريع را در فريزر 20- درجه نيز نگهداري نمود. در اين شرايط توجه به نکات زير ضروري است.

سويه‌هاي سخت رشد مانند هموفيلوس انفلوآنزا و نيسريا گنوره در اين دما قابل نگهداري نمي‌باشند و بايد در  فريزر 70- درجه نگهداري شوند.

سويه‌هاي بارشد سريع در اين دما عمر کمي دارند و تعداد زيادتري از آنها از بين مي‌روند. بنابراين توصيه مي‌شود براي اطمينان از حيات سويه‌ها هر چند ماه ، طبق روش زير کشت داده شوند.

يک ويال از فريزر بيرون آورده و و سريعا زير آب جاری ولرم محتويات آنرا ذوب نمائيد. نمونه را روي محيط آگار خوندار يا شکلاته ( در مورد باکتريهاي سخت رشد ) تلقيح کرده و به مدت 24-18 ساعت در دماي 2±35 درجه ودر صورت نياز در شرايط CO₂ انکوبه نماييد. اين باکتري مي‌تواند براي آزمايشهاي کنترل داخلي کيفيت در آزمايشگاه يا براي تهيه working control بکار رود. قبل از هر اقدام بايد از خالص بودن نمونه ، اطمينان حاصل کرد. ويال مورد استفاده بعد از ذوب شدن بايد دور انداخته شده و بهيچوجه مجددا فريز نگردد.

کشتهاي working control :  عبارتست ازکشت مجدد از کشت ذخيره فريز شده که براي کنترل کيفيت محيط کشت و.. استفاده مي‌شود.

از کشت ذخيره تا 3 پاساژ پشت سر هم مي‌توان انجام داد . پس از آن ، نمونه بايد دور انداخته شده و از يک کشت ذخيره فريز شده ديگر براي تهيه کشتهاي  working control  استفاده شود. پاساژهاي مکرر( بيش از 3 پاساژ)، احتمال تغيير فنوتيپي سويه‌ها را افزايش مي‌دهد.

براي تهيه working control ، از کشت ذخيره فريز شده ، روي پليت يا آگار شيبدار تلقيح  و آنرا به مدت يک شبانه‌روز تا زماني که رشد مناسبي بدست آيد، انکوبه نمائيد. در مورد ارگانيسمهاي با رشد سريع اين پليت يا آگار شيبدار را مي‌توان در 8-2 درجه سانتيگراد يا در دماي اتاق تا مدت 4 هفته نگهداري نمود. بعد از هر پاساژ، خالص بودن و مورفولوژي کلني‌ها را بررسي نمائيد.

2- استفاده از روغن معدني در دماي اتاق :

1- محيط کشت Brain Heart Infusion Agar (BHIA) را با شيب کم در لوله تهيه نماييد. براي باکتريهاي مشکل‌پسند مانند گونوکک ، مننگوکک ، استرپتوکک پنومونيه و هموفيلوس آنفلوانزا ، لازم است محيط شکلات آگار را با افزودن 5% خون گوسفند به محيط فوق پس از خروج از اتوکلاو و رسيدن به دمای 50 درجه سانتی‌گراد و قرار دادن در بن‌ماري 80 درجه سانتي‌گراد به مدت 15 دقيقه تهيه نمود.

2- روغن معدني ( يا پارافين مايع ) را در حرارت خشک ( 170 درجه سانتي‌گراد به مدت يکساعت ) استريل نمائيد.

3- ميکروب مورد نظر را روي محيط کشت  دهيد.

4- بعد از بدست آوردن کشت کافي ، روغن استريل را به مقدار cc 1 روي سطح محيط بريزيد.

5- در صورت نياز به کشت مجدد ، نمونه از سطح آگار (زير روغن ) برداشته مي‌شود.

6- بعد از 12-6 ماه تجديد کشت نماييد.

1-  کشت عمقي و نگهداري در دماي اتاق :

اين روش فقط براي باکتريهايي که مشکل‌پسند نيستند مانند استافيلوکک وخانواده انتروباکترياسه بکار مي‌رود.

1-    يک محيط کشت آگار بدون کربوهيدرات مانند TSA را باعمق زياد در لوله تهيه نماييد.

2-    باکتري را بصورت کشت عمقي در در اين محيط تلقيح نماييد.

3-    اين محيط را 24 ساعت در اتو 35 درجه انکوبه نمائيد.

4-    در لوله را با درپيچ يا چوب پنبه ببنديد.

5-    لوله در پيچ‌دار را در پارافين مايع فرو ببريد به گونه‌اي که کاملا در لوله را بپوشاند.

6-    کشتها را در حرارت اتاق نگهداري نمائيد.

7-    هرساله سوش موردنظر را تجديد نمائيد.

2-  کشت عمقي در محيط سيستين تريپتيکيس آگار (CTA) براي نيسريا و استرپتوکک :

1-    محيط CTA را در لوله تهيه نماييد .

2-    باکتري را بطو عمقي در اين محيط کشت دهيد.

3-    محيط را بمدت 24 ساعت در اتو 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.

4-    در لوله را با چوب‌پنبه يا در پيچ ببنديد.

5-    لوله در پيچ‌دار را در پارافين مايع فرو ببريد به گونه‌اي که کاملا در لوله را بپوشاند.

6-    براي نيسريا لوله را در 35 درجه نگهداري و هر دو هفته کشت را تجديد نمائيد . براي استرپتوکک لوله را در حرارت اتاق نگهداري کرده و هر ماه تجديد کشت کنيد.

3-  محيط کشت Cooked meat  براي باکتريهاي بيهوازي :

1-    باکتري را  در لوله‌هاي حاوي محيط Cooked meat کشت دهيد.

2-    محيط را بمدت 24 ساعت در اتو 35 درجه سانتي‌گراد انکوبه نماييد.

3-    در لوله را با چوب‌پنبه يا در پيچ ببنديد.

4-    کشتها را در حرارت اتاق نگهداري نمائيد.

5-    هردو ماه کشت را تجديد نمائيد.