پاتولوژي
پاتولوژيدر اصل به معناي آسيب شناسي است و به مطالعه و شناسايي اختلالات عملي و تغييرات ساختاري بافت ها مي‌پردازد .به‌طور کلي آسيب شناسي عبارت از مطالعه بيماري‌هاست و به عنوان شاخه اي از علم پزشکي به بررسي علل پيدايش بيماري‌ها و عوارض ناشي از آنها مي‌پردازد. بديهي است در هنگام بروز يک بيماري، تغييراتي در بافت‌هاي مختلف بدن ايجاد ميشود که در واقع مطالعه همين تغييرات مبنا و اساس پاتولوژي را تشکيل مي‌دهد. لذا پاتولوژي علمي است که راجع به تغييرات مختلف بدن در هنگام بيماري بحث و گفتگو مي‌نمايد. به چگونگي اين تغييرات پاتوژنزيز (pathogenesis) مي‌گويند که به دو گروه تشريحي و باليني تقسيم ميشود.
پاتولوژي 4 جنبه مهم از يک بيماري را بررسي مي‌کند که عبارت است از:
1)اتيولوژي (علت شناسي)،
2)پاتوژنز(مکانيسم ايجاد)،
3)مرفولوژي (ريخت شناسي)
4)اهميت باليني
رشته‌هاي پاتولوژي
1) پاتولوژي تشريحي(Anatomical) : عبارت است از مطالعه تغييرات ساختماني اعم از ميکروسکوپي و ماکروسکوپي و ضايعات وارده به سلول هاي بدن که شامل:
الف) اتوپسي (نمونه برداري از بافت مرده) ،
ب) بيوپسي (نمونه برداري از بافت زنده)
ج) سيتوپاتولوژي (سلول شناسي).
2) پاتولوژي باليني( (clinical که علايم بيماري را در خون، ادرار، مايع نخاعي، خلط، ترشحات واژن در بخش هاي مختلف ميکروب شناسي، بيوشيمي،سرم شناسي و... بررسي مي‌نمايد.
روش تکنيکي آسيب شناسي (هيستوتکنيک )
تمام مراحل کاري از ابتداي پذيرش نمونه درآزمايشگاه پاتولوژي تا آماده سازي لام و بررسي آن در زير ميکروسکوپ به عنوان روش هاي تکنيکي آسيب شناسي در نظر گرفته ميشود که شامل هفت مرحله جداگانه است:
1) فيکساسيون،
2) نمونه برداري يا پاس دادن،
4) آبگيري و آغشتگي،
4) قالب‌گيري،
5) برش با ميکروتوم،
6) رنگ‌آميزي و
7) مونتاژ لام و لامل .
بديهي است دقت در هر يک از اين مراحل همراه با سرعت در کار لازمه تهيه يک برش ميکروسکوپي مناسب و لام خوب براي تشخيص دقيق است به طوري که اشکال درهر يک از روش هاي مختلف به کار گرفته شده مي‌تواند سبب کاهش دقت تشخيص بيماري و به دنبال آن ايجاد اشکال در روند درمان بيمار شود.
در ادامه توضيح مختصري درباره هريک از اين مراحل پرداخته ميشود:
1) فيکساسيون(fixation)
اين مرحله صرفا"جهت حفظ ساختمان فيزيکي بافت و براي جلوگيري از اتوليز (Autolysis) آن انجام ميشود. نمونه جراحي شده بايد بلافاصله درون ماده فيکساتيو قرار بگيرد. براي اين کار بايد نوع بافت، درجه حرارت دوران پروسه، زمان فيکساسيون و PH محلول هاي به‌کار برده شده را در نظر داشت. براي مثال مايع پايدارکننده يا فيکساتيو، بايد سلول زنده را هر چه سريعتر کشته و به سرعت در بافت نفوذ نمايد و در صورت امکان ساختمان طبيعي سلول و بافت را تغيير ندهد و همچنين بعضي از مواد نيمه مايع و کلوئيدي را با عمل فيکساسيون تبديل به مواد نيمه جامد (gel) کند. در مجموع ماده فيکساتيو را بايد طوري انتخاب کرد که در بافت و همچنين در رنگ‌آميزي آن خللي ايجاد نکند. براي انجام اين کار فيکساتيوهاي مختلفي وجود دارد ولي فرمالين 10% معمول ترين فيکساتيو به کار گرفته شده است. زمان ماندن نمونه در فرمالين (فرم آلدئيد) بستگي به حجم و نوع نمونه دارد به‌طوري‌که هر 4 ساعت 7/2 ميلي متر فرمالين داخل بافت نفوذ مي‌کند ولي معمولا" نمونه‌ها را 24 ساعت در فرمالين قرار مي‌دهند. البته لازم به ذکر است نمونه‌هايي مانند استخوان، دندان و به طور کلي بافت هايي که داراي رسوبات آهکي باشد بايدپيش از فيکساسيون، دکلسيفيه شود تا بتوان آن را براي مراحل بعدي آماده کرد.
2) دکلسيفيکاسيون به معني آزادکردن مواد معدني (کلسيم) از بافت استخواني و شامل مراحل زير است:
الف) تهيه نسوج ، ب) فيکساسيون، ج) دکلسيفيکاسيون، د) خنثي کردن و ه) شستشو با آب.
محلول دکلسيفيکاسيون بايد داراي خصوصيات زير باشد:
الف)کلسيم را به طور کلي از بافت آزاد کند،
ب) به بافت اصلي آسيبي وارد نکند و
ج)در رنگ‌آميزي اختلال ايجاد نکند.
2) نمونه برداري يا پاس دادن:
براي اجراي اين مرحله، نمونه بايد از لحاظ اندازه کاملا" مناسب باشد. چنانچه نمونه بزرگتر از حد معمول باشد مواد آبگير مانند گزيلول، الکل و ... نمي‌تواند در آن نفوذ کند و چنانچه خيلي کوچک باشد تهيه نمونه و به دنبال آن برش و تهيه لام و... مشکل خواهد شد. براي هر کدام از نمونه‌ها بايد مشخصات بافت را به‌طور کامل گزارش کرد. اين مشخصات شامل: حالت، ابعاد، ضخامت، رنگ، ترشحات و... است. همين‌طور براي جداکردن نمونه‌ها از يکديگر و شناسايي آنها بايد شماره نمونه همراه با سال نمونه‌برداري را به‌وسيله مداد روي کاغذ نوشته و همراه با بافت داخل ظروف مخصوص گذاشته و نمونه را براي مراحل بعدي آماده کرد.در شکل (1) ميز پاس همراه با وسايل مربوطه مشاهده ميشود.
3) آبگيري و آغشتگي:
اين کار توسط دستگاهي به نام تيشو پروسسور (Tissue Processor) انجام ميشود که شامل دوازده ظرف حاوي محلول هاي مختلف است. اين محلول‌ها 3 وظيفه بر عهده دارد:
الف) آبگيري، ب) شفاف کردن و ج) آغشتگي با پارافين
حجم کلي هر ظرف 1000ميلي ليتر است و ترتيب آنها بدين صورت است:
ظروف شماره 1و2 حاوي فرمالين 10% است. نمونه برش داده شده حدود 3 ساعت در فرمالين قرار مي‌گيرد. (چنانچه اين زمان بيشتر باشد اشکالي ايجاد نمي‌کند ). در بعضي موارد، در ظرف شماره 2 به جاي فرمالين از آب مقطر استفاده ميشود. مدت زمان قرار گرفتن نمونه در آب مقطر يک ساعت است.
ظرف‌هاي سوم تا ششم شامل الکل (متانول) است، ظرف شماره 3 الکل 70%و ظرف شماره 4 الکل 80%، ظرف شماره 5 الکل 90% و ظرف شماره 6 الکل 96% است. علت صعودي انتخاب کردن اين الکل‌ها اين است که آبگيري به آرامي انجام شود. زمان قرار گرفتن نمونه در هر کدام از اين الکل‌ها يک ساعت است. به طور کلي اتانول بهتر از متانول آبگيري مي‌کند ولي به علت هزينه بالاتر، از متانول استفاده ميشود. در عين حال متانول خاصيت رنگبري هم دارد. اين مرحله بسيار مهم است و چنانچه آبگيري با الکل به خوبي انجام نشود مراحل بعدي نيز دچار اشکال شده وسبب چروکيدگي بافتها خواهد گرديد.
ظروف شماره‌هاي 7و8 حاوي الکل متانول مطلق 100% استکه در مجموع 4ساعت آبگيري آنها به طول مي‌انجامد. ظروف 9 و10 گزيلول است که وظيفه شفاف‌سازي بافت و خارج کردن الکل از آن را به عهده دارد.
ظروف شماره 11و12 حاوي پارافين است. پارافين در دماي آزمايشگاه جامد است و بايد به دماي ذوب ( 60 درجه سانتي گراد)، برسد براي همين منظور دو ظرف آخر داراي المنتي است که باعث توليد حرارت در ظرف و ذوب شدن پارافين ميشود. بعد از اينکه نمونه داخل پارافين مذاب قرار گرفت. اين ماده داخل بافت نفوذ کرده و بافت به حالت آغشتگي مي‌رسد. پارافين در شکاف و درز بافت نفوذ مي‌کند و در دماي آزمايشگاه بافت سفت و سخت شده و قابل برش با ميکروتوم خواهد شد. لازم به ذکر است که ماده آغشتگي با ماده قالب‌گيري بايد يکي باشد.
دستگاه تيشو پروسسور مجهز به دکمه‌هاي خودكار تنظيم زمان (Timer)، دکمه‌هاي روشن و خاموش و بالا و پائين و چرخشي و چراغ‌هايي براي اطمينان از روشن بودن دستگاه و همچينين دکمه‌هاي تنظيم برنامه و تعيين سيکل دستگاه است تا معمولا" حدود 18 ساعت طول مي‌کشد که يک سيکل کامل شود. در شکل شماره (2) دستگاه تيشوپروسسور مشاهده ميشود.
4) قالب‌گيري :
براي قالب‌گيري بايد ماده آغشتگي (پارافين) را در دماي 60 درجه سانتي گراد داخل فور ذوب کرده و مقداري موم به نسبت 1 به 10 به آن اضافه کرد. از موم براي قالب‌گيري محکم استفاده ميشود. در صورتيکه فقط از پارافين استفاده شود قالب‌ها بسيار شکننده خواهند شد. پس از اين مرحله کار روي نمونه‌ها وارد مسير جديدي ميشود که شامل قالب‌گيري، برش و رنگ‌آميزي و در نهايت مونتاژ لام و لامل است. براي قالب‌گيري بايد نمونه‌هاي آبگيري شده را به وسيله پنست داخل ظرف مخصوص قالب‌گيري قرار داده، روي آن محلول موم و پارافين ريخت و بعد از گذشت چند دقيقه شماره نمونه‌ها را روي آنها قرار داد. اين عمل در اصطلاح کوله کردن نمونه‌ها ناميده ميشود و نياز به دقت کافي دارد. براي کامل‌تر شدن اين مرحله قالب‌ها تا شروع زمان برش داخل يخچال قرار مي‌گيرد.
5) برش با ميکروتوم :
براي شروع اين مرحله به چند دستگاه جداگانه نياز است که اين دستگاه‌ها و وسايل شامل: ميکروتوم، تيشوفلوت، چراغ مطالعه و قلم الماس است.
1) ميکروتوم: دستگاهي است که از آن براي تهيه برش هاي نازک از بافتي که به صورت بلوک در آمده، استفاده مي‌کنند. اين دستگاه داراي توانايي برش بافت در ضخامت‌هاي گوناگون است و آن را به دو بخش بيروني و دروني تقسيم مي‌کنند. در بخش دروني دستگاه، چرخ دنده‌هاي مختلفي تعبيه شده است که به وسيله دسته ميکروتوم به چرخش در مي‌آيد و ميله تنظيم ميکرومتر، درجه تنظيمي را به داخل منتقل مي‌کند. با چرخش دسته مي‌توان برش هايي به ضخامت 1 تا 30 ميکرون و حتي بالاتر تهيه کرد. قسمت بيروني دستگاه شامل دسته، گيره بلوک، پيچ تنظيم زاويه بلوک، جاي نگهدارنده چاقوي ميکروتوم، پيچ تنظيم کننده زاويه تيغ ميکروتوم، درجه ميکرومتر و پيچ يا دسته جلوبرنده چاقو به وسيله دست است. بر روي دسته، ميله‌اي تعبيه شده که به‌وسيله آن مي‌توان دسته را قفل نموده تا کاملا ثابت شود و بدين‌وسيله احتمال آسيب به دست يا خراب شدن بلوک کم ميشود. در شکل (3) دستگاه ميکروتوم مشاهده ميشود.
تيشوفلوت
اين دستگاه در واقع ظرفي است که در آن آب ريخته ميشود و قسمتي در زير يا اطراف آن تعبيه شده که محل قرارگيري گرمکن دستگاه است و به‌وسيله کليد کنترل کننده، دماي آب به دلخواه تنظيم ميشود که اين دما به پارافين اطراف نمونه بستگي دارد. لازم به توضيح است که داخل ظرف بايد تيره باشد. بدين منظور معمولا" به وسيله تفلون يا رنگ کوره اي سياه پوشانده ميشود. در واقع اين دستگاه براي برطرف کردن چين وچروک بافت هاي برش خورده است.
3) چراغ مطالعه: اين وسيله بر روي ميکروتوم و آب و الکل و تيشوفلوت احاطه داشته و نور مناسب و کافي آن از خستگي مفرط چشم جلوگيري مي‌کند. در شکل (4) دستگاه تيشوفلوت به همراه چراغ مطالعه مشاهده ميشود.
قلم الماس: همانطور که از نامش پيداست، براي نوشتن به کار مي‌رود. نوک قلم بايد از الماس باشد تا بتواند شماره نمونه‌ها را به‌طور خوانا روي لام که جنس شيشه دارد حک کند.
همانطور که گفته شد مرحله پنجم از هستيوتکنيک برش با ميکروتوم است. در اين مرحله نمونه‌هاي قالب‌گيري شده را به وسيله ميکروتوم به ضخامت 5 ميکرون برش مي‌دهند. ميکروتوم موجود در آزمايشگاه‌ها معمولا" از نوع دواري است که براي برش بهتر لازم است نمونه‌ها را حدود يک دقيقه روي يخ قرار داد؛ البته بعضي از ميکروتوم‌ها ازنوع انجمادي است. طوريکه گاز CO2 از داخل محفظه اي آزادشده و اين گاز ايجاد سرما مي‌کند و برش بافتها به طورخود به‌خود در انجماد صورت مي‌گيرد.
6) رنگ‌آميزي بافتها :
اين مرحله شامل دو نوع روتين و اختصاصي است:
رنگ‌آميزي روتين: روش رنگ‌آميزي که در آزمايشگاه‌هاي پاتولوژي به طور معمول و روتين استفاده ميشود، روش هماتوکسيلين- ائوزين است. با اين روش هسته سلول رنگ بنفش و سيتوپلاسم رنگ صورتي به خود مي‌گيرد.
دراين رنگ‌آميزي، ابتدا 3 حمام گزيلول موجود است که براي شفاف سازي و از بين بردن پارافين باقي مانده در اطراف بافتها استفاده ميشود. نمونه‌ها در هر ظرف گزيلول به مدت 5 دقيقه قرار داده ميشود. بعد از گزيلول 4 ظرف الکل درجه بندي شده قرار دارد. نمونه‌ها را در هر کدام به مدت 2-1 دقيقه گذاشته و بعد با آب شستشو داده ميشود و بعد بلافاصله در ظرف حاوي هماتوکسيلين قرار مي‌گيرد. زمان قرار گرفتن در هماتوکسيلين 15-10 دقيقه است كه اين زمان بستگي به تازه يا کهنه بودن رنگ دارد. لازم است بعد از اين مرحله نمونه‌ها با آب شستشو داده شده و بافت هاي اضافي اطراف آنها پاک شود. بعد از تميز کردن لام‌ها، آنها را داخل اسيد الکل شناور کرده تا رنگ هاي اضافي داخل بافت از بين برود. بعد از اسيد الکل نوبت به کربنات کلسيم مي‌رسد. وظيفه اين محلول، رنگ‌آميزي زمينه بافت است و باعث ميشود هسته آبي به نظر برسد. ظرف بعدي ائوزين است که باعث قرمز شدن سيتوپلاسم مي‌گردد. بعد از چند ثانيه که نمونه ها داخل ائوزين قرار گرفت آنها را با آب شستشو داده، بعد به ترتيب داخل 4 ظرف الکل قرار مي‌گيرد. اين الکل‌ها هم درجه بندي شده و به ترتيب 70-80-90 و 96درجه است و بافتها در هر کدام، حدود 5-3 ثانيه قرار مي‌گيرد. 2 ظرف آخر شامل گزيلول است که براي شفاف تر شدن بافتها استفاده ميشود. زمان قرارگيري نمونه‌ها درگزيلول در حدود 5-3دقيقه است.
رنگ‌آميزي اختصاصي: در اين رنگ‌آميزي هر جزء از سلول رنگ خاصي به خود مي‌گيرد.
رنگ‌آميزي اختصاصي شامل:
1- رنگ‌آميزي برش هاي انجمادي،
2- رنگ‌آميزي بافت همبندي،
3- رنگ‌آميزي نمونه‌هاي دستگاه عصبي،
4- رنگ‌آميزي براي برخي مواد سيتوپلاسميک،
5- رنگ‌آميزي براي آنزيم‌ها،
6- رنگ‌آميزي براي ميکروارگانيسم‌ها و
7- رنگ‌آميزي سيتولوژيک.
رنگ‌آميزي‌هاي اختصاصي داراي روش‌هاي مختلفي است که هر کدام توسط پزشک معالج درخواست و در آزمايشگاه پاتولوژي بسته به شرايط موجود انجام ميشود. در شکل شماره (5) ظروف رنگ‌آميزي مشاهده ميشود.
7) مونتاژ لام و لامل :
براي اين کارابتدا لازم است پشت لام‌ها را خشک کرده و بعد لاملي را که قبلا" روي آن يک تا د و قطره چسب مخصوص ريخته شده، با پنس روي لام قرار داد. بعد اطراف لام را کاملا" تميز کرده و اجازه داد تا در دماي آزمايشگاه خشک شود. در آخر شماره نمونه‌ها روي برچسب نوشته شده و با دقت روي لام‌ها چسبانده ميشود. سپس لام‌ها همراه با برگه در خواست آنها در اختيار پاتولوژيست براي تشخيص نهايي قرار گيرد.
بررسي پاتولوژيک بافت به روش Frozen Section
روشي است که جراح در حين عمل جراحي براي اطلاع از تشخيص سريع و دقيق نوع تومور (بد خيم يا خوش خيم بودن) و تعيين نوع عمل جراحي درخواست مي‌کند . بنابراين در اين مسير سرعت عمل نقش بسيارمهمي ايفا مي‌کند. Section Frozen در زمينه‌هاي مختلف مورد استفاده است به عنوان مثال وقتي قسمتي از روده جهت بررسي نوع تومور توسط جراح خارج ميشود جهت اطمينان از آناستوموز دو انتهاي آزاد روده، جراح درخواست آزمايش Frozen مي‌دهد. لذا براي جلوگيري از عمل مجدد و صرفه جويي در وقت و هزينه و... از اين روش تشخيصي استفاده ميشود. به طور کلي Frozen Section به مجموعه عملياتي گفته ميشود که روند آمادگي بافت جهت تشخيص پاتولوژيک را کوتاه و زمان تشخيص را براي آگاهي جراح سريعتر مي‌کند. به علاوه اجزاي سلولي مانند چربي‌ها مي‌تواند با روش هاي رنگ‌آميزي خاص، زير ميکروسکوپ ديده شود. براي انجام اين کار از دستگاهي به نام کرايو استيت (Cryostat) استفاده ميشود. در اين دستگاه ميکروتوم، بافت و چاقو همگي در يک اتاقک با کنترل دما که سطح آن با پلي‌اورتان عايق‌بندي شده، قرار دارد. اصول کار بدين صورت است که نمونه‌اي از بافت مورد نظر بيمار جدا شده و بلافاصله از اتاق عمل به آزمايشگاه پاتولوژي فرستاده ميشود. قطعه مورد نظر توسط پاتولوژيست از بافت جدا وبراي شروع عمليات آماده ميشود. سپس نمونه در دستگاه قرار داده شده، پس از منجمد شدن براي برش آماده مي‌گردد. ميکروتوم‌هاي Cryostat مي‌تواند جهت بريدن نمونه‌هاي بافتي با مقاطعي به ضخامت 50-1 ميکرومتر تنظيم شود. بعد از برش، نمونه براي رنگ‌آميزي آماده است. براي اين کار بايد ابتدا نمونه را با الکل 95 درجه فيکس کرد، بعد از گذشت چند ثانيه نمونه در محلول هماتوکسيلين قرار داده ميشود، زمان براي اين محلول 3-2دقيقه است .کربنات و ائوزين محلول‌هاي بعدي است که زمان براي هر کدام از اين محلول‌ها حدود 3-2 ثانيه است. بعد نوبت به 4 الکل درجه‌بندي شده (70-80-90-95) مي‌رسد. نمونه در هر کدام از اين محلول‌ها حدود 1 تا 2 ثانيه شناور ميشود و در نهايت براي شفاف تر شدن، نمونه در دو ظرف گزيلول قرارداده شده و براي مونتاژ و تشخيص آماده ميشود و در انتها جواب آزمايش توسط پاتولوژيست تلفني به جراح اطلاع داده ميشود تا روند صحيح ادامه عمل پيگيري شود. در شکل (6) نمايي از يک دستگاه کرايو استيت مشاهده ميشود.
تفاوت روش روتين با روش Frozen Section در بررسي نمونه‌هاي بافتي به‌شرح ذيل است:
1) اختلاف نماي مرفولوژيک از نظر طرح بافتي و نوع سلولي، بين نمونه فروزن و پرمننت وجود دارد که در ارگانهاي مختلف شدت اين موضوع متفاوت است،
2) به دليل افزايش اندازه هسته‌ها و سلول‌ها امکان خطاي تشخيص و عدم امکان رسيدن به تشخيص نهايي در روش Frozen بيشتر است و
3) در اين روش ممکن است نوع سلول کاملا شبيه انواع ديگري از سلول‌ها شده و امکان تشخيص دقيق فراهم نباشد، به عنوان مثال ممکن است ماکروفاژ به شکل اپيتليال ديده شود.