رنگ‌آمیزی گرم
رنگ‌آمیزی گرم (Gram staining) یکی از مهم‌ترین ومتداولترین روش‌های رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند. رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد. دررنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری‌های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می‌شود. گرچه هر دو گروه یعنی باکتریهای گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتریهای گرم مثبت یک لایه ضخیمی‌است از پپتیدوگلیکان*[۱]، ولی در باکتریهای گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌رسد.
هدف:
از رنگ امیزی گرم به دو جهت استفاده می شود:
- شناسایی جنس باکتری
-آنتخاب آنتی بیوتیک مناسب (باکتری های گرم مثبت در مقایسه با باکتری های گرم منفی نسبت به پنی سیلین G حسّاسیت بیشتری دارند)
با این حال همه یباکتری ها را نمی توان با رنگ امیزی گرم مشاهده نمود.
مواد مورد نیاز:
لام‘سرم فیزیو لژی‘لوپ‘رنگ کریستال ویوله‘رنگ لوگل‘الکل استون‘رنگ سافرانین‘میکروسکوپ
روش رنگ‌آمیزی گرم
پیش از آغاز رنگ آمیزی نخست باید یک فروتی از محیط کشت خالص باکتری بر روی لام تهیّه کنیم، در ادامه مراحل رنگ آمیزی گرم به قرار زیر هستند:
نخست رنگ کریستال ویوله رابه مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه برروی فروتی باکتری روی لام می ریزیم، درنتیجه همه باکتریها به رنگ بنفش درخواهد درآمد.
پس از شستشوی فروتی با آب، رنگ کریستال ویوله را با افزودن لوگول به مدّت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه تثبیت می کنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس‌هایی می‌نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می‌شود. پس ازاین مرحله، همه باکتریها کماکان به رنگ بنفش مشاهده می‌شوند .
مرحله رنگ زدایی:
مهم‌ترین مرحله رنگ آمیزی است. دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت ۱۵ تا۲۰ ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می‌گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می‌گیرد. درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه‌های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه‌ها وغشا می‌گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می‌دهد. ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایه ی پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی‌شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .در انتها سطح فروتی راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه می‌پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن با میکروسکوپ مورد بررسی قرار می گیرد.
نتیجه:
دراین مرحله باکتریهای بی رنگ (باکتری های گرم منفی) به رنگ قرمز درمی‌آیند وباکتری‌های بنفش (باکتری های گرم مثبت) بدون تغییر رنگ باقی می‌مانند .