روشهای آزمایشگاهی تشخیص تب مالت
( سرولوژی)
تهیه کننده: دکتر سید عباس حسینی تقوی
اين جزوه با توجه به توصيه هاي WHO تدوين شده وهدف از تنظيم اين جزوه ارائه يك دستورالعمل استاندارد جهت آزمايش رايت مي باشد ضمنا" كوشش شده است كه روشهاي رايج تشخيص آزمايشگاهي بروسلوز را به شكل يكسان در آورده در حد امكان از گزارشهاي متفاوت تيتراسيون يك نمونه واحد جلوگيري به عمل آيد.
تب مالت بيماري عفوني است و عوامل ايجاد كننده آن در انسان كوكوباسيل گرم منفي ميباشد كه شامل:
1- بروسلا B-Melitensis كه بيشتر در بز ،گاو و گوسفند و مسئول اكثر موارد تب مالت در ايران مي باشد.
2- بروسلا B-Abortus در گاو
3- بروسلاB-Suis در خوك
4- بروسلا B-Canis در سگ ايجاد بيماري مي كند.
آنتي ژنهاي بروسلا: آنتي ژنهاي AوM به ليپو پلي ساكاريد ديواره سلول باكتري مربوط ميباشد ضمنا" بروسلا آنتي ژن مشترك با ويبره كلره داشته و واكسيناسيون بر عليه وبا تيتر آنتي بادي بروسلا را بصورت كاذب با بعضي از آنتي ژنهاي ساخته شده بالا مي برد.
آنتي بادي:
در پاسخ ايمني هومورال بروسلوز ) IgG,IgM 1IgGوIgG2 IgA,( مقدار جزئي IgE توليد گرديده كه بويژهIgG , IgM در آزمايشگاههاي سرولوژي دخالت دارند ودر عفونت بروسلوز, IgM از روز پنجم تا هفتم ظاهر شده و در طي 13 تا 21 روز پس از ورود باكتري در بدن به ميزان نهايي خواهد رسيد. IgA نيز به مقدار كم در فاصله بين ظهور دو ايمونوگلوبولين فوق الذكر بوجود مي آيد.
در حالت بيماري تيتر IgG به مقدار بالا تر رسيده و دوام بيشتري دارد و در بررسي سرولوژي بروسلوز هنگامي كه سرم مورد آزمايش قرار مي گيرد از ارزش زيادي برخوردار است . بدون ترديد چنانچه سرم هفته اول آلودگي مورد بررسي باشد هيچگونه ايمونو گلوبوليني موجود نبوده و در نتيجه آزمايش منفي خواهد بود. در هفته دوم نقش برتر را IgM خواهد داشت. بين هفته دوم وسوم تشكيل IgG شروع شده و سه هفته پس از آن به اوج خواهد رسيد و در حالت عفونت كماكان نقش غالب را خواهد داشت .براي تشخيص سرولوژي بروسلوز انسان ازمايشهاي رزبنگال , سرو آگلوتيناسيون رايت , 2- مر كاپتواتانول , ثبوت عناصر مكمل وآنتي گلوبولين كومبس به روش استاندارد ويا استفاده از روشهاي استاندارد شده توسط توليد كننده هاي داخلي انجام مي پذيرد. اكثر بيماران مبتلا به بروسلوز حاد در تمامي آزمايشها واكنش مثبت نشان ميدهد معمولا" آزمايشهاي رزبنگال و رايت به جهت آنكه هر دو ايمونوگلوبين GوM در آنها دخالت دارند زودتر از ديگر آزمايشها واكنش دارد.
در آزمايشهاي 2- مركاپتواتانول وثبوت عناصر مكمل, IgG مداخله نموده كه از نقطه نظر تفكيك وضعيت ايمني يا عفونت مفيد مي باشد.
در مواردي كه آنتي بادي هايي وجود داشته باشند و آگلوتيناسيون واضح ايجاد نمي نمايد آزمايش
كومبس ازارزش خاصي برخوردار است.
در بررسي سرولوژي بيماري تعيين تفاوت تيتر دو نمونه سرم در حداقل به فاصله دو هفته با ارزش مي باشد ضمنا" در افرادي كه تماس مكرر با آنتي ژن بروسلا دارند آزمايشهاي سرمي مثبت بدون علائم باليني مشاهده مي شود از اينرو نتايج آزمايشهاي سرمي در بروسلوز شغلي از اهميت محدودي برخوردار است.
گاهی اوقات نیز نتایج مثبت کاذب ناشی از واکنش متقاطع سایر آنتی بادیهای باکتریها با آنتی ژن بروسلا مشاهده می گردد. بنا براین به منظور تشخیص بروسلوز بکارگیری روشهای استاندارد آزمایشگاهی توام با اطلاعات کسب شده اپید میولوژی - کلینیکی- آزمایشگاهی مورد نظر میباشد.
روشهای سرولوژی استاندارد:
1-روش آگلوتیناسیون سریع با آنتی ژن ویژه این روش
(لوازم مورد لزوم):
1-پلیت شیشه ای مخصوص آزمایش سرولوژی
2-آنتی ژن قابل مصرف و فاقد اتو آگلوتيناسيون
3-كنترل مثبت و كنترل منفي
4-روتاتور واپليكاتور جهت مخلوط نمودن سرم و آنتي ژن
آنتي ژن رزبنگال به رنگ قرمز و باPH اسيدي برابر 65/3 و به ميزان 8% جرم ميكربي بروسلا آبورتوس در دسترس مي باشد و بيشتر اين روش جهت تشخيص اوليه در برنامه هاي كنترل و ريشه كني بروسلوز به عنوان تست غربالي بكار برده مي شود و توصيه مي شود بعلت احتمال بروز پديده پروزون و مشاهده پاسخ منفي كاذب ، آزمايش تمامي نمونه هاي سرم با روش لوله اي انجام شود . در صورت انجام ازمايش به روش سريع و بر روي پليت ، از يك قطره سرم ( حدود 25-30 ميكرو ليتر )و يك قطره آنتي ژن (حدود25-30ميكروليتر) استفاده مي شود و موارد مثبت به روش لوله تعيين مقدار شود و از تيتراسيون تست با پليت خودداري گردد و سعي شود كه در اين آزمايش از كنترل مثبت و منفي استفاده شود و آگلوتيناسيون با نمونه كنترلي منفي و مثبت مقايسه گردد.
2-آزمون آگلوتيناسيون رايت در لوله:
(لوازم و مواد مورد نیاز):
1-لوله هموليز
3- نمك طعام و فنل
4-پارافيل جهت بستن درب لوله ها
5-سرم كنترل مثبت و منفي جهت تهيه شاهد
طرز تهيه سرم فيز يولوژي فنيكه :
5/8 گرم كلرور سديم و 5 گرم فنل را در 1000 ميلي ليتر آب مقطر حل نماييد. توصيه مي شود براي از بين بردن پديده پروزن بجاي 5/8 گرم 50 گرم نمك طعام و5 گرم فنل را در يك ليتر آب حل نماييد.
2-آنتي ژن مخصوص لوله اي ساخت داخل كه فاقد اتو آگلوتيناسيون باشد و قابل مصرف طبق تاريخ ساخت مي بايستي تا هنگام مصرف دور از نور و در يخچال 4 درجه سانتي گراد نگهداري شود.
روش آزمايش :
در يك رديف لوله هموليز از سرم مورد آزمايش رقت هاي 1:5 , لغايت 1:1280 به ترتيب ذيل تهيه نماييد :
A: در لوله اول8/ . ميلي ليتر و در لوله هاي بعدي 5/ . ميلي ليتر سرم فيزيولوژي فنيكه بريزيد .
B: 2/ . ميلي ليتر از سرم مورد آزمايش به لوله اول اضافه كرده (رقت 1:5 ) از لوله اول نيم ميلي ليتر به لوله دوم اضافه كنيد (رقت 1:10 ) مخلوط نموده به همين ترتيب تا لوله آخر ادامه داده و از لوله آخر 5/ . ميلي ليتر اضافه را بعد از مخلوط كردن دور بريزيد .
C: آنتي ژن را به مقدار مورد نياز تهيه (در صورت نياز به رقيق شدن بر حسب دستور العمل رقيق گردد) و به هر لوله 5/ . ميلي ليتر اضافه نماييد در نتيجه رقت هاي نهايي با احتساب حجم آنتي ژن 1:10 , 1:20 , 1:80 و ... الي آخر بدست آيد .
D: تهيه شاهد منفي و مثبت:
(1) براي تهيه شاهد منفي 5/ . ميلي ليتر آنتي ژن رقيق شده يا آماده مصرف را در يك لوله هموليز ريخته و نيم ميلي ليتر محلول سرم فيزيولوژي فنيكه به آن مي افزاييم .
(2) براي تهيه شاهد مثبت يك نمونه سرم مثبت قوي را به صورت 1:5 رقيق نماييد .
(100 ميكروليتر سرم + 400 ميكروليتر سرم فيزيولوژي فنيكه) سپس 5/ . ميلي ليتر از آن را با 5/ . ميلي ليتر آنتي ژن آماده مصرف در يك لوله ریخته و مخلوط نماييد .
E: محتوي لوله ها را كاملا" مخلوط و درب لوله ها را با پارافيلم بسته و به مدت 20 تا 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتي گراد قرار داده و به ترتيب نتيجه را قرائت مي كنيم .
قرائت نتايج :
بر مبناي ميزان شفافيت مايع فوقاني (با مقايسه لوله شاهد ) و آگلوتيناسيون ايجاد شده نتايج بر حسب تيتر لوله ها (رقت لوله ها ) گزارش مي گردد و با بيشترين رقت لوله اي كه نسبت به لوله شاهد منفي ، 50 درصد شفافيت يا آگلو تيناسيون را نشان مي دهد تيتر نهايي آزمايش بدست مي دهد . ضمنا" در مورد تفسير آزمايش رايت وتعيين تيتر آلودگي هنوز اتفاق نظر وجود ندارد . در كتب و مقالات پزشكي غربي به علت اينكه بيماري شيوع چنداني ندارد و تعداد مبتلايان اندك مي باشد و فقط بيماري يك بيماري شغلي محسوب شده و به وسيله بروسلا آبورتوس و سوئيس با تماس مكرر بوجود مي آيد و آلودگي با بروسلا ملي تنسيس رواج ندارد، تیتر قابل ارزش برای درمان 1:160 میباشد، ولی در ایران بیشتر آلودگی با بروسلا ملیتنسیس گزارش شده و شيوع بيشتري دارد و تيتر 1:80 به بالا براي درمان ارزش بيشتري دارد ليكن تيتر هاي پايين تر و بويژه در ارتباط با بيماريهاي غير شغلي نبايستي كم اهميت در نظر گرفته شود، مگر در صورتيكه از نظر كلينيكي تظاهرات وجود نداشته ، تيتر آزمايش دو هفته بعد رو به افزايش نبوده ، كشت خون منفي بوده ، يا در آزمايش IgG , 2ME فعال وجود نداشته باشد .
آزمايش 2- مركاپتواتانول: 2-Mercaptoethanol(2ME)Brucella Agglutination Test
تستهاي معمول آگلوتيناسیون براي تشخيص بروسلوز تنها وجوديا عدم آگلوتينين هاي ضد آنتي ژن بروسلا را در سرم بيمار مشخص مي نمايد. بدون آن كه قادر به افتراق نوع آگلو تينين هاي موجود يعنيIgM از IgG باشند . آزمايش 2ME براي تعيين ماهيت ايمونوگلوبولين موجود در سرمي كه سبب اگلوتيناسيون مي شود انجام ميگيرد . 2- مركاپتواتانول ماده احياء كننده ايست كه درغلظت معين باندهاي دي سولفيد (disulphide bond ) IgM را شكسته وباعث از بين رفتن خاصيت آگلو تيناسيون IgM مي شود . اگر سرم بيمار قدرت آگلوتيناسيون خود را پس از مجاورت با 2ME از دست بدهد نشاندهنده اينست كه آگلوتينين موجود IgM بوده است ولي اگر قدرت آگلوتيناسيون سرم پس از تاثير 2ME باقي بماند دليل بر وجود آگلوتينين IgG و تيتر بدست آمده همان تيتر IgG ميباشد . آزمايش 2ME به همان روش آگلوتيناسيون لوله اي رايت (Wright) انجام مي گيرد با اين تفاوت كه رقتهاي سرم ، در سرم فيزیولوژي حاوي 2ME تهيه مي گردد. مي توان بجاي 2ME از ماده ديگري بنام Dithiothrietol( محلولي با غلظت 005/0 مولكول گرم ) استفاده كرد .
ضمنا به سبب قابليت اكسيد شدن بيش از حد 2MEدر رقتهاي بالا اعتقاد بر اين است كه بايد از بافر تازه تهيه شده 2MEبراي تعيين طبيعت آنتي بادي موجود در سرم بيمار استفاده گرددو پيشنهاد مي نمايد كه براي اين هدف بهتر است ماده احياء كننده را تازه و روزانه و با سرم مورد آزمايش مخلوط نموده و سپس آزمون آگلوتيناسيون را ا نجام داد .
روش انجام آزمايش :
مواد مورد لزوم :
1- محلول غليظ2- مركاپتو اتانول
2- لوله هموليز
3- آنتي ژن لوله اي انستيتو پاستوريا انستيتو رازي كه اتو آگلو تيناسيون نداشته و يكنواخت و هموژن باشد .
-A ابتدا محلول 2/0 ملكول گرم در ليتر 2ME در آب مقطر تهيه مي كنيم (68/0 ميلي ليتر مركاپتو اتانول در 0 5 ميلي ليتر آب مقطر)
سپس به تعداد نمونه هاي سرم مورد آزمايش لوله هموليز در نظر گرفته ودر هر لوله 3/0 ملي ليتر سرم فيزیولوژي + 2/0 ميلي ليتر سرم بيمار + 5/0 ميلي ليتر محلول مركاپتو اتانول مي ريزيم .
-B لوله را بمدت يكساعت در اتو 37 درجه قرار ميدهيم تا مركاپتو اتانول بر روي IgM اثر نمايد.
-C لوله هارا از اتو خارج ساخته و براي هر نمونه سرم به مانند سرو آگلوتيناسيون در لوله تعداد مورد نياز لوله هموليز در نظر مي گيريم و رقتهاي سريال (serial dilution) تهيه مي كنيم بدين ترتيب كه به استثنا لوله اول ( كه لوله حاوي سرم و مركاپتواتانول مي باشد ) در تمام لوله ها 5/0 ميلي ليتر سرم فيزیولوژي مي ريزيم سپس از محتوي لوله اول 5/0 ميلي ليتر به لوله دوم مي ريزيم و پس از مخلوط كردن از لوله دوم 5/0 ميلي ليتر به لوله سوم انتقال مي دهيم. اين عمل را تا لوله ما قبل آخر ادامه مي دهيم و از اين لوله5/0 ميلي ليتر دور ريخته مي شود. ( لوله آخر به عنوان كنترل است كه فقط حاوي سرم فيزیولوژي وآنتي ژن خواهد بود )رقت هاي نهايي از 1:10تا 1:5120 خواهد بود .
-D به هر لوله مقدار 5/0 ميلي ليتر از همان آنتي ژن سرو آگلو تيناسيون لوله اي مي ريزيم (يا آنتي ژن مخصوص 2ME ساخت انستیتو پاستور)
-E لوله هارا به مدت 24-20 ساعت در اتو 37 درجه قرار مي دهيم و سپس لوله هارا از نظر وجود آگلو تيناسيون بررسي مي كنيم.
پس از تاثير 2ME بر روي سرم آگلوتينين هاي با ماهيت IgM حذف می شوند و چون آگلوتيناسيون مورد مشاهده تنها ناشي از وجود IgG است لذا تيتر IgG موجود در سرم را نشان مي دهد . ضمنا توصيه مي شود كه محلول رقيق شده 2ME در روز مصرف تهيه شود و تامپون مصرفي بدون فنل مورد استفاده قرار گيرد .
بطور معمول تيتر قبل از درمان 1:40 به بالا در آزمايش2- مركاپتو اتانول مثبت تلقي شده ضمن آنكه هر تيتري در اين آزمايش و بويژه تيتر 1:20 مي تواند نشانه اي از آلودگي بوده مگر اين كه خلاف آن ثابت شود .
آزمايش آنتي هيو من گلو بو لين (( كومبس رايت )):
روش آزمايش : به منظور انجام اين آزمايش به ترتيب زير عمل مي شود :
1- رقتهاي سرم مورد آزمايش مشابه روش سرو گلوتيناسيون در لوله با سرم فيولوژي يا بافر فسفات با 2/7 = PH به حجم 5/0 ميلي ليتر تهيه شود .
2- آنتي ژن رايت به نسبت توصيه سازنده با سرم فيزیولوژي رقيق شود و سپس به حجم 5/0 ميلي ليتر به هر لوله اضافه گردد.
3- لوله ها را به مدت 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتيگراد قرار داده و پس از اين مدت نتيجه را قرائت نماييد .
4- پس از ثبت نتايج ، تمام لوله ها ئيكه داراي آگلو تيناسيون كامل يا جزيي باشند كنار گذاشته شود.
5- بقيه لوله ها را به مدت 10 دقيقه با دور 2000 در دقيقه سانتريفوژ نموده و مايع رويي را با دقت جدا نموده و دور بريزيد و رسوب را با يك ميلي ليتر بافر فسفات يا سرم فيزیولوژي مخلوط و مجددا سانتريفوژ كنيد .
6- مرحله سانتريفوژ را 3 مرتبه تكرار نماييد .
7- رسوب نهايي را با 9/0 ميلي ليتر بافر فسفات يا سرم فيزیولوژي و 1/0 ميلي ليتر آنتي هيومن گلوبولين مخلوط و به مدت 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه قرار دهيد .
8- پس از انقضاي زمان مذكور نتايج واكنش را قرائت كنيد .
در بروسلوز مزمن و طولاني ممكن است IgM ديگر توليد نشوند و آنتي بادي IgG و كلاس هاي IgG1 و IgG2 كه بيش از 80% IgG موجود را تشكيل مي دهد نيز سنتز نگردد. و تنها آنتي بادي ضد بروسلايي موجود شامل IgG3و IgG4 باشد كه از نظر كمي و كيفي خيلي ضعيفتر از IgG1 و IgG2 و IgM ضد بروسلايي واكنش مي دهند . توضيح اينكه اين آنتي بادي ها در تست رايت نتيجه منفي كاذب بوجود مي آورند ولي در صورت افزودن آنتي هيومن گلوبولين و انجام تست كومبس رايت نتيجه مثبت حاصل خواهد شد و در تست كومبس رايت تيتر قابل ارزش 40/1 به بالا مي باشد و اگر علامتي از نظر بيماري نيز مشاهده شود نتيجه را با ارزش تر مي نمايد.
(( طرز تهيه بافر فسفات با 2/7=PH و غلظت ده برابر بدين ترتيب است ))
1- فسفات مونو سديك با دو ملكول آب =g 03/2
2- فسفات دي سديك بدون آب = g 36/12
3- نمك طعام = g 80
را در يك ظرف يك ليتري ريخته و حجم مي رسانيم و در موقع مصرف 1:10 رقيق مي كنيم .
لازم به توضيح است براي تشخيص آزمايشگاهي بروسلوز آزمايشهاي مختلفي با حساسيتهاي گوناگون به نامهاي آزمون ثبوت مكمل ، آزمون هماگلوتيناسيون غير مستقيم، آزمونهاي ايمونواسي و روش الكتروفورز counter-current ((CIEP نيز انجام مي گيرد.
( سرولوژی)
تهیه کننده: دکتر سید عباس حسینی تقوی
اين جزوه با توجه به توصيه هاي WHO تدوين شده وهدف از تنظيم اين جزوه ارائه يك دستورالعمل استاندارد جهت آزمايش رايت مي باشد ضمنا" كوشش شده است كه روشهاي رايج تشخيص آزمايشگاهي بروسلوز را به شكل يكسان در آورده در حد امكان از گزارشهاي متفاوت تيتراسيون يك نمونه واحد جلوگيري به عمل آيد.
تب مالت بيماري عفوني است و عوامل ايجاد كننده آن در انسان كوكوباسيل گرم منفي ميباشد كه شامل:
1- بروسلا B-Melitensis كه بيشتر در بز ،گاو و گوسفند و مسئول اكثر موارد تب مالت در ايران مي باشد.
2- بروسلا B-Abortus در گاو
3- بروسلاB-Suis در خوك
4- بروسلا B-Canis در سگ ايجاد بيماري مي كند.
آنتي ژنهاي بروسلا: آنتي ژنهاي AوM به ليپو پلي ساكاريد ديواره سلول باكتري مربوط ميباشد ضمنا" بروسلا آنتي ژن مشترك با ويبره كلره داشته و واكسيناسيون بر عليه وبا تيتر آنتي بادي بروسلا را بصورت كاذب با بعضي از آنتي ژنهاي ساخته شده بالا مي برد.
آنتي بادي:
در پاسخ ايمني هومورال بروسلوز ) IgG,IgM 1IgGوIgG2 IgA,( مقدار جزئي IgE توليد گرديده كه بويژهIgG , IgM در آزمايشگاههاي سرولوژي دخالت دارند ودر عفونت بروسلوز, IgM از روز پنجم تا هفتم ظاهر شده و در طي 13 تا 21 روز پس از ورود باكتري در بدن به ميزان نهايي خواهد رسيد. IgA نيز به مقدار كم در فاصله بين ظهور دو ايمونوگلوبولين فوق الذكر بوجود مي آيد.
در حالت بيماري تيتر IgG به مقدار بالا تر رسيده و دوام بيشتري دارد و در بررسي سرولوژي بروسلوز هنگامي كه سرم مورد آزمايش قرار مي گيرد از ارزش زيادي برخوردار است . بدون ترديد چنانچه سرم هفته اول آلودگي مورد بررسي باشد هيچگونه ايمونو گلوبوليني موجود نبوده و در نتيجه آزمايش منفي خواهد بود. در هفته دوم نقش برتر را IgM خواهد داشت. بين هفته دوم وسوم تشكيل IgG شروع شده و سه هفته پس از آن به اوج خواهد رسيد و در حالت عفونت كماكان نقش غالب را خواهد داشت .براي تشخيص سرولوژي بروسلوز انسان ازمايشهاي رزبنگال , سرو آگلوتيناسيون رايت , 2- مر كاپتواتانول , ثبوت عناصر مكمل وآنتي گلوبولين كومبس به روش استاندارد ويا استفاده از روشهاي استاندارد شده توسط توليد كننده هاي داخلي انجام مي پذيرد. اكثر بيماران مبتلا به بروسلوز حاد در تمامي آزمايشها واكنش مثبت نشان ميدهد معمولا" آزمايشهاي رزبنگال و رايت به جهت آنكه هر دو ايمونوگلوبين GوM در آنها دخالت دارند زودتر از ديگر آزمايشها واكنش دارد.
در آزمايشهاي 2- مركاپتواتانول وثبوت عناصر مكمل, IgG مداخله نموده كه از نقطه نظر تفكيك وضعيت ايمني يا عفونت مفيد مي باشد.
در مواردي كه آنتي بادي هايي وجود داشته باشند و آگلوتيناسيون واضح ايجاد نمي نمايد آزمايش
كومبس ازارزش خاصي برخوردار است.
در بررسي سرولوژي بيماري تعيين تفاوت تيتر دو نمونه سرم در حداقل به فاصله دو هفته با ارزش مي باشد ضمنا" در افرادي كه تماس مكرر با آنتي ژن بروسلا دارند آزمايشهاي سرمي مثبت بدون علائم باليني مشاهده مي شود از اينرو نتايج آزمايشهاي سرمي در بروسلوز شغلي از اهميت محدودي برخوردار است.
گاهی اوقات نیز نتایج مثبت کاذب ناشی از واکنش متقاطع سایر آنتی بادیهای باکتریها با آنتی ژن بروسلا مشاهده می گردد. بنا براین به منظور تشخیص بروسلوز بکارگیری روشهای استاندارد آزمایشگاهی توام با اطلاعات کسب شده اپید میولوژی - کلینیکی- آزمایشگاهی مورد نظر میباشد.
روشهای سرولوژی استاندارد:
1-روش آگلوتیناسیون سریع با آنتی ژن ویژه این روش
(لوازم مورد لزوم):
1-پلیت شیشه ای مخصوص آزمایش سرولوژی
2-آنتی ژن قابل مصرف و فاقد اتو آگلوتيناسيون
3-كنترل مثبت و كنترل منفي
4-روتاتور واپليكاتور جهت مخلوط نمودن سرم و آنتي ژن
آنتي ژن رزبنگال به رنگ قرمز و باPH اسيدي برابر 65/3 و به ميزان 8% جرم ميكربي بروسلا آبورتوس در دسترس مي باشد و بيشتر اين روش جهت تشخيص اوليه در برنامه هاي كنترل و ريشه كني بروسلوز به عنوان تست غربالي بكار برده مي شود و توصيه مي شود بعلت احتمال بروز پديده پروزون و مشاهده پاسخ منفي كاذب ، آزمايش تمامي نمونه هاي سرم با روش لوله اي انجام شود . در صورت انجام ازمايش به روش سريع و بر روي پليت ، از يك قطره سرم ( حدود 25-30 ميكرو ليتر )و يك قطره آنتي ژن (حدود25-30ميكروليتر) استفاده مي شود و موارد مثبت به روش لوله تعيين مقدار شود و از تيتراسيون تست با پليت خودداري گردد و سعي شود كه در اين آزمايش از كنترل مثبت و منفي استفاده شود و آگلوتيناسيون با نمونه كنترلي منفي و مثبت مقايسه گردد.
2-آزمون آگلوتيناسيون رايت در لوله:
(لوازم و مواد مورد نیاز):
1-لوله هموليز
3- نمك طعام و فنل
4-پارافيل جهت بستن درب لوله ها
5-سرم كنترل مثبت و منفي جهت تهيه شاهد
طرز تهيه سرم فيز يولوژي فنيكه :
5/8 گرم كلرور سديم و 5 گرم فنل را در 1000 ميلي ليتر آب مقطر حل نماييد. توصيه مي شود براي از بين بردن پديده پروزن بجاي 5/8 گرم 50 گرم نمك طعام و5 گرم فنل را در يك ليتر آب حل نماييد.
2-آنتي ژن مخصوص لوله اي ساخت داخل كه فاقد اتو آگلوتيناسيون باشد و قابل مصرف طبق تاريخ ساخت مي بايستي تا هنگام مصرف دور از نور و در يخچال 4 درجه سانتي گراد نگهداري شود.
روش آزمايش :
در يك رديف لوله هموليز از سرم مورد آزمايش رقت هاي 1:5 , لغايت 1:1280 به ترتيب ذيل تهيه نماييد :
A: در لوله اول8/ . ميلي ليتر و در لوله هاي بعدي 5/ . ميلي ليتر سرم فيزيولوژي فنيكه بريزيد .
B: 2/ . ميلي ليتر از سرم مورد آزمايش به لوله اول اضافه كرده (رقت 1:5 ) از لوله اول نيم ميلي ليتر به لوله دوم اضافه كنيد (رقت 1:10 ) مخلوط نموده به همين ترتيب تا لوله آخر ادامه داده و از لوله آخر 5/ . ميلي ليتر اضافه را بعد از مخلوط كردن دور بريزيد .
C: آنتي ژن را به مقدار مورد نياز تهيه (در صورت نياز به رقيق شدن بر حسب دستور العمل رقيق گردد) و به هر لوله 5/ . ميلي ليتر اضافه نماييد در نتيجه رقت هاي نهايي با احتساب حجم آنتي ژن 1:10 , 1:20 , 1:80 و ... الي آخر بدست آيد .
D: تهيه شاهد منفي و مثبت:
(1) براي تهيه شاهد منفي 5/ . ميلي ليتر آنتي ژن رقيق شده يا آماده مصرف را در يك لوله هموليز ريخته و نيم ميلي ليتر محلول سرم فيزيولوژي فنيكه به آن مي افزاييم .
(2) براي تهيه شاهد مثبت يك نمونه سرم مثبت قوي را به صورت 1:5 رقيق نماييد .
(100 ميكروليتر سرم + 400 ميكروليتر سرم فيزيولوژي فنيكه) سپس 5/ . ميلي ليتر از آن را با 5/ . ميلي ليتر آنتي ژن آماده مصرف در يك لوله ریخته و مخلوط نماييد .
E: محتوي لوله ها را كاملا" مخلوط و درب لوله ها را با پارافيلم بسته و به مدت 20 تا 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتي گراد قرار داده و به ترتيب نتيجه را قرائت مي كنيم .
قرائت نتايج :
بر مبناي ميزان شفافيت مايع فوقاني (با مقايسه لوله شاهد ) و آگلوتيناسيون ايجاد شده نتايج بر حسب تيتر لوله ها (رقت لوله ها ) گزارش مي گردد و با بيشترين رقت لوله اي كه نسبت به لوله شاهد منفي ، 50 درصد شفافيت يا آگلو تيناسيون را نشان مي دهد تيتر نهايي آزمايش بدست مي دهد . ضمنا" در مورد تفسير آزمايش رايت وتعيين تيتر آلودگي هنوز اتفاق نظر وجود ندارد . در كتب و مقالات پزشكي غربي به علت اينكه بيماري شيوع چنداني ندارد و تعداد مبتلايان اندك مي باشد و فقط بيماري يك بيماري شغلي محسوب شده و به وسيله بروسلا آبورتوس و سوئيس با تماس مكرر بوجود مي آيد و آلودگي با بروسلا ملي تنسيس رواج ندارد، تیتر قابل ارزش برای درمان 1:160 میباشد، ولی در ایران بیشتر آلودگی با بروسلا ملیتنسیس گزارش شده و شيوع بيشتري دارد و تيتر 1:80 به بالا براي درمان ارزش بيشتري دارد ليكن تيتر هاي پايين تر و بويژه در ارتباط با بيماريهاي غير شغلي نبايستي كم اهميت در نظر گرفته شود، مگر در صورتيكه از نظر كلينيكي تظاهرات وجود نداشته ، تيتر آزمايش دو هفته بعد رو به افزايش نبوده ، كشت خون منفي بوده ، يا در آزمايش IgG , 2ME فعال وجود نداشته باشد .
آزمايش 2- مركاپتواتانول: 2-Mercaptoethanol(2ME)Brucella Agglutination Test
تستهاي معمول آگلوتيناسیون براي تشخيص بروسلوز تنها وجوديا عدم آگلوتينين هاي ضد آنتي ژن بروسلا را در سرم بيمار مشخص مي نمايد. بدون آن كه قادر به افتراق نوع آگلو تينين هاي موجود يعنيIgM از IgG باشند . آزمايش 2ME براي تعيين ماهيت ايمونوگلوبولين موجود در سرمي كه سبب اگلوتيناسيون مي شود انجام ميگيرد . 2- مركاپتواتانول ماده احياء كننده ايست كه درغلظت معين باندهاي دي سولفيد (disulphide bond ) IgM را شكسته وباعث از بين رفتن خاصيت آگلو تيناسيون IgM مي شود . اگر سرم بيمار قدرت آگلوتيناسيون خود را پس از مجاورت با 2ME از دست بدهد نشاندهنده اينست كه آگلوتينين موجود IgM بوده است ولي اگر قدرت آگلوتيناسيون سرم پس از تاثير 2ME باقي بماند دليل بر وجود آگلوتينين IgG و تيتر بدست آمده همان تيتر IgG ميباشد . آزمايش 2ME به همان روش آگلوتيناسيون لوله اي رايت (Wright) انجام مي گيرد با اين تفاوت كه رقتهاي سرم ، در سرم فيزیولوژي حاوي 2ME تهيه مي گردد. مي توان بجاي 2ME از ماده ديگري بنام Dithiothrietol( محلولي با غلظت 005/0 مولكول گرم ) استفاده كرد .
ضمنا به سبب قابليت اكسيد شدن بيش از حد 2MEدر رقتهاي بالا اعتقاد بر اين است كه بايد از بافر تازه تهيه شده 2MEبراي تعيين طبيعت آنتي بادي موجود در سرم بيمار استفاده گرددو پيشنهاد مي نمايد كه براي اين هدف بهتر است ماده احياء كننده را تازه و روزانه و با سرم مورد آزمايش مخلوط نموده و سپس آزمون آگلوتيناسيون را ا نجام داد .
روش انجام آزمايش :
مواد مورد لزوم :
1- محلول غليظ2- مركاپتو اتانول
2- لوله هموليز
3- آنتي ژن لوله اي انستيتو پاستوريا انستيتو رازي كه اتو آگلو تيناسيون نداشته و يكنواخت و هموژن باشد .
-A ابتدا محلول 2/0 ملكول گرم در ليتر 2ME در آب مقطر تهيه مي كنيم (68/0 ميلي ليتر مركاپتو اتانول در 0 5 ميلي ليتر آب مقطر)
سپس به تعداد نمونه هاي سرم مورد آزمايش لوله هموليز در نظر گرفته ودر هر لوله 3/0 ملي ليتر سرم فيزیولوژي + 2/0 ميلي ليتر سرم بيمار + 5/0 ميلي ليتر محلول مركاپتو اتانول مي ريزيم .
-B لوله را بمدت يكساعت در اتو 37 درجه قرار ميدهيم تا مركاپتو اتانول بر روي IgM اثر نمايد.
-C لوله هارا از اتو خارج ساخته و براي هر نمونه سرم به مانند سرو آگلوتيناسيون در لوله تعداد مورد نياز لوله هموليز در نظر مي گيريم و رقتهاي سريال (serial dilution) تهيه مي كنيم بدين ترتيب كه به استثنا لوله اول ( كه لوله حاوي سرم و مركاپتواتانول مي باشد ) در تمام لوله ها 5/0 ميلي ليتر سرم فيزیولوژي مي ريزيم سپس از محتوي لوله اول 5/0 ميلي ليتر به لوله دوم مي ريزيم و پس از مخلوط كردن از لوله دوم 5/0 ميلي ليتر به لوله سوم انتقال مي دهيم. اين عمل را تا لوله ما قبل آخر ادامه مي دهيم و از اين لوله5/0 ميلي ليتر دور ريخته مي شود. ( لوله آخر به عنوان كنترل است كه فقط حاوي سرم فيزیولوژي وآنتي ژن خواهد بود )رقت هاي نهايي از 1:10تا 1:5120 خواهد بود .
-D به هر لوله مقدار 5/0 ميلي ليتر از همان آنتي ژن سرو آگلو تيناسيون لوله اي مي ريزيم (يا آنتي ژن مخصوص 2ME ساخت انستیتو پاستور)
-E لوله هارا به مدت 24-20 ساعت در اتو 37 درجه قرار مي دهيم و سپس لوله هارا از نظر وجود آگلو تيناسيون بررسي مي كنيم.
پس از تاثير 2ME بر روي سرم آگلوتينين هاي با ماهيت IgM حذف می شوند و چون آگلوتيناسيون مورد مشاهده تنها ناشي از وجود IgG است لذا تيتر IgG موجود در سرم را نشان مي دهد . ضمنا توصيه مي شود كه محلول رقيق شده 2ME در روز مصرف تهيه شود و تامپون مصرفي بدون فنل مورد استفاده قرار گيرد .
بطور معمول تيتر قبل از درمان 1:40 به بالا در آزمايش2- مركاپتو اتانول مثبت تلقي شده ضمن آنكه هر تيتري در اين آزمايش و بويژه تيتر 1:20 مي تواند نشانه اي از آلودگي بوده مگر اين كه خلاف آن ثابت شود .
آزمايش آنتي هيو من گلو بو لين (( كومبس رايت )):
روش آزمايش : به منظور انجام اين آزمايش به ترتيب زير عمل مي شود :
1- رقتهاي سرم مورد آزمايش مشابه روش سرو گلوتيناسيون در لوله با سرم فيولوژي يا بافر فسفات با 2/7 = PH به حجم 5/0 ميلي ليتر تهيه شود .
2- آنتي ژن رايت به نسبت توصيه سازنده با سرم فيزیولوژي رقيق شود و سپس به حجم 5/0 ميلي ليتر به هر لوله اضافه گردد.
3- لوله ها را به مدت 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتيگراد قرار داده و پس از اين مدت نتيجه را قرائت نماييد .
4- پس از ثبت نتايج ، تمام لوله ها ئيكه داراي آگلو تيناسيون كامل يا جزيي باشند كنار گذاشته شود.
5- بقيه لوله ها را به مدت 10 دقيقه با دور 2000 در دقيقه سانتريفوژ نموده و مايع رويي را با دقت جدا نموده و دور بريزيد و رسوب را با يك ميلي ليتر بافر فسفات يا سرم فيزیولوژي مخلوط و مجددا سانتريفوژ كنيد .
6- مرحله سانتريفوژ را 3 مرتبه تكرار نماييد .
7- رسوب نهايي را با 9/0 ميلي ليتر بافر فسفات يا سرم فيزیولوژي و 1/0 ميلي ليتر آنتي هيومن گلوبولين مخلوط و به مدت 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه قرار دهيد .
8- پس از انقضاي زمان مذكور نتايج واكنش را قرائت كنيد .
در بروسلوز مزمن و طولاني ممكن است IgM ديگر توليد نشوند و آنتي بادي IgG و كلاس هاي IgG1 و IgG2 كه بيش از 80% IgG موجود را تشكيل مي دهد نيز سنتز نگردد. و تنها آنتي بادي ضد بروسلايي موجود شامل IgG3و IgG4 باشد كه از نظر كمي و كيفي خيلي ضعيفتر از IgG1 و IgG2 و IgM ضد بروسلايي واكنش مي دهند . توضيح اينكه اين آنتي بادي ها در تست رايت نتيجه منفي كاذب بوجود مي آورند ولي در صورت افزودن آنتي هيومن گلوبولين و انجام تست كومبس رايت نتيجه مثبت حاصل خواهد شد و در تست كومبس رايت تيتر قابل ارزش 40/1 به بالا مي باشد و اگر علامتي از نظر بيماري نيز مشاهده شود نتيجه را با ارزش تر مي نمايد.
(( طرز تهيه بافر فسفات با 2/7=PH و غلظت ده برابر بدين ترتيب است ))
1- فسفات مونو سديك با دو ملكول آب =g 03/2
2- فسفات دي سديك بدون آب = g 36/12
3- نمك طعام = g 80
را در يك ظرف يك ليتري ريخته و حجم مي رسانيم و در موقع مصرف 1:10 رقيق مي كنيم .
لازم به توضيح است براي تشخيص آزمايشگاهي بروسلوز آزمايشهاي مختلفي با حساسيتهاي گوناگون به نامهاي آزمون ثبوت مكمل ، آزمون هماگلوتيناسيون غير مستقيم، آزمونهاي ايمونواسي و روش الكتروفورز counter-current ((CIEP نيز انجام مي گيرد.