روش استاندارد انجام آزمايشهای اندازه گيری هموگلوبين ، PCV و شمارش سلولی

Measurement of Blood
Hemoglobin using Hemiglobincyanide(HiCN) Method

l      ابتداآهن هموگلوبين توسط فري سيانيد پتاسيم اكسيده شده (همي گلوبين)

l      سپس همي گلوبين توسط سيانيد پتاسيم تبديل به همي گلوبين سيانيد ميشود.

l      واكنش در حرارت اتاق

l      زمان لازم براي ايجاد واكنش 5 دقيقه يا كمتر

 

مشخصات معرف:

l      شفاف وزرد رنگ

l      زمان لازم براي ايجاد واكنش 5 دقيقه يا كمتر

l      دترژانها ليز گلبول هاي قرمزورسوب پروتئين ها را افزايش مي دهند.

l      در طول موج بيشتر از 480 نانومتر جذب نوری ندارد.

l      pH=7-7.4

l      در صورت كدورت دور ريخته شود.

l      هرماه  بصورت تازه تهيه شود.

 

Sampling

l      Venipuncture

l      K2EDTA or Na2EDTA(1.5-2.2mg/ml blood)

l      Fresh sample

l      Solution of sample &Reagent is stable

l      K3EDTA

 

مواد, وسايل وتجهيزات:

l      كليه وسايل شيشه اي مثل پي پتها ولوله ها استاندارد وكاليبره

l      از لحاظ شيميايي تميز باشند.

l      اسپكتروفتومتر كاليبره

l      استانداردهموگلوبين

 

Reference Method: Macrodilution

 

 

Routin procedure

l      20ميكروليتر خون + 5ميلي ليتر معرف

 

روش آزمايش :

l      غلظت هموگلوبين نمونه  با استفاده از جذب نوري نمونه در طول موج 540 نانومتر در مقابل بلانك با كمك جذب نوري  و غلظت استانداردو يا با كمك منحني استاندارد محاسبه ميشود.

l      واحد اندازه گيري گرم در ليتر

 

تداخلات:

l      Lipoproteinemia

l      Lipemia

l      WBC>20×10^9/L

l      Plt>700×10^9/L

l      Hb S

 

خطا ها:

l      خطا هاي نمونه گيري

l      خطا هاي روش انجام آزمايش

l      خطا هاي مربوط به مواد و تجهيزات

l      خطا هاي آزمايشگر

 

 

Procedure For Determining Packed Cell Volume By Microhematocrit Method

نسبت  حجم گلبولهاي قرمز به حجم خون كامل  ميباشد.  PCV

 

اصول آزمايش:

n      خونگيري مويرگي؛وريدي وشرياني

n      K2EDTAضد انعقاد مناسب جهت كاليبراسيون

n      K3EDTA به علت ايجاد چروكيدگي در گلبول هاي قرمزMCV  را 2% كاهش وMCHC  را به همين ميزان افزايش ميدهد.

n      نگهداري نمونه در دماي° 26-18

n      آزمايش حد اكثر 6 ساعت پس از نمونه گيري انجام شود.

n      خطاي قابل قبول دراين روش1% ±ميباشد.

n      انجام آزمايش بصورت دو تايی

 

مشخصات لوله:

n      جنس از شيشه مخصوص

n      طول لوله 5/0± 75ميليمتر

n      ضخامت جداره 2/0 ميليمتر

n      قطر داخلي 0.085 +ـ 55/1

n      داراي باند آبي در يك انتها

 

مشخصات دستگاه ميكروسانتريفوژ:

n      شعاع چرخش بيشتر از 8سانتيمتر

n      در عرض 30 ثانيه به حداكثر سرعت برسد

n      RCF حدود 10-15 هزارg  در محيط بمدت حداقل 5 دقيقه  بدون افزايش دمااز 45  درجه

n      داراي زمان سنج اتوماتيك .(با قابليت   تنظيم حداقل 30ثانيه)                   

 

n      RCF=Relative Centrifugal Field

n      RPM=Relative Per Minute

n      RCF=0.00001118  × r  × N

 

روشآزمايش:

•         50ميكروليتر خون

•         3/2-4/3طول لوله از خون پرشود.

•         طول خمير مسدود كننده كمتراز 4 ميليمتر نباشد.

•         نمونه ها بصورت مضاعف آزمايش شوند.

•         نتايج حداكثر پس از 10دقيقه خوانده شوند.

•         تفاوت نمونه هاي مضاعف از 05/0بيشتر نباشد.

 

ميانگين ودامنه مرجع:

n      مردان (0.54-0.4)0.47

n      زنان(0.47-0.37)0.42

 

منابع خطا:

n      خطاهاي نمونه گيري

n      خطاهاي لوله

n      خطاي خواندن

n      خطاي بدام افتادن پلاسما

 

n      افزايش كاذب:

هيپو ناترمي

بدام افتادن پلاسما

n      كاهش كاذب:

ضد انعقاد اضافي

هموليز

هيپرناترمي

 

كاليبراسيون و کنترل کيفی دستگاه ميکروهماتوکريت

 

1-بررسي سرعت

2-بررسي زمان سنج

3-بررسي صحت ابزار خوانش

 

روش غير مستقيم بررسی كاليبراسيون:

n      چند نمونه خون با  PCVکمتر از 5/0 و حاوی ضدانعقاد (K2EDTA  را پس از بيست بار سروته نمودن به صورت دوتايی به مدت 3 ، 5 ، 7، 9 و 11 دقيقه سانتريفوژ کرده و نتايج ثبت مي گردد که در صورت مناسب بودن توان دستگاه (g) نتايج حاصله از دقيقه 5 به بعد می بايست بدون تغيير باقی بماند .

 

Blood Cell Counting

Leukocyte Counting By Manual method

 

n      عدم دقت اين  روش 5/6% كه در موارد لكوپني به 15% ميرسد.

n      از خون حاوي EDTA استفاده ميشود.

n      مايع رقيق كننده اسيد استيک 2% (رقت 20/1 ) گلبولهاي قرمز را ليز ميكند.

n      در موارد لكوسيتوز رقت 100/1 يا 200/1   

n      در موارد لكوپني رقت 10/1

 

منابع خطا:

n      مخلوط نکردن به ميزان کافی

n      خطاي آزمايش كننده

n      خطاي ناشي از وسايل

n      خطاي ميدان ديد

n      هر چه تعداد سلولهاي شمارش شده بيشتر باشد ميزان خطا كمتر ميشود.

 

            .Platelet counting By Manual Method

 

منابع خطا:

n      جمع آوري نمونه

n      تهيه رقيق كننده(فاقد ذرات خارجي مزاحم)

n      تكنيك رقيق سازي

n      پاكيزه نبودن لام

n      عدم دقت اين روش وقتي كه حداقل 100سلول شمارش شود11% واگر 40 پلاكت شمارش شود15%

n      به دليل تمايل پلاكتها به چسبيدن به يكديگر؛جسم خارجي وشيشه شمارش مشكل ميبا شد.

n      نمونه: خون وريدي حاوي ضد انعقاد EDTA

n      محلول رقيق كننده اگزالات آمونيوم 1%  با آب مقطر

n      روش انتخابي شمارش پلاكتها استفاده از ميكروسكوپ فاز كنتراست مي باشد

 

 

Dr.P.Dahim

Health Reference Laboratory